重医附一院AM：超声触发轴向梯度电学梯度腱骨梳用于腱骨界面整合-MedSci.cn
背景介绍
腱骨界面（TBI）损伤在肌肉骨骼系统中常见，其修复的核心挑战在于术后梯度界面结构再生的困难。尽管手术可恢复解剖连续性，但产生的纤维瘢痕组织力学性能不足，导致25%–35%的再撕裂率。天然TBI并非简单组织连接，而是由肌腱、纤维软骨和骨组成的连续梯度结构。这种结构源于胶原纤维空间排列的差异，这些差异在生理载荷下诱导内源性电信号沿纤维通道轴向传导，并产生由差异调控的生物电梯度，从而维持界面稳态。然而，损伤后，组织异质性形成的内源性电通路被破坏，轴向传导和局部电信号的空间聚焦减弱，从而限制了对界面再生的指导。临床研究表明，传统电刺激（ES）治疗虽广泛用于促进TBI损伤修复的辅助手段，但在体内受限于浅穿透和所产生的电信号弥散空间分布，难以提供修复所需的生理电信号。因此，重建空间受限的轴向电传导通路对于恢复生物电调控和促进梯度TBI再生至关重要。多级压电水凝胶和由压电颗粒形成的连续导电网络已广泛用于向体内深部区域递送电信号。然而，大多数电信号传导系统缺乏通道化轴向传导结构。因此，物理刺激下产生的电信号横向扩散并迅速衰减，限制了空间传输精度。此外，仅由身体运动或组织摩擦触发的压电输出往往稳定性差且电场强度不可控，使可靠的电信号递送困难。低强度聚焦超声（US）具有在生物组织中可调的亚厘米空间聚焦能力，可克服在体内实现电信号精确激发和调制的关键限制。US可非侵入性地将机械能递送至损伤界面并激活局部压电材料，从而产生稳定可控的电信号输出。因此，将US触发与梯度压电颗粒和通道化传导结构相结合，是重建TBI生理相关内源性电信号传导的有前景策略。该方法限制横向扩散和信号衰减，同时增强向深部区域的递送。高空间分辨率电生理指导被认为是精确调控细胞功能的关键策略，因为它可以指导细胞迁移和谱系分化。由于电信号的传播路径和有效衰减受几何构型约束，水凝胶微针阵列可作为点对点轴向电传导通道，限制横向信号扩散并将其递送至深部界面区域。每个微针可作为独立电通道单元，使US触发的电信号沿针轴以最小损耗传播至深部区域，并在结构上重现天然TBI的纤维通道化电传导模式。在软骨-骨过渡区，界面再生强烈依赖电刺激强度，电通道必须同时提供深部轴向递送和梯度轴向输出。研究表明，骨和软骨作为天然压电组织，在机械刺激下可产生内源性电信号以调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）的命运：较低电场强度（25–34 mV）倾向于诱导软骨分化，而较高电场强度（40–80 mV）促进成骨分化。受此发现启发，团队构建了微针电通道系统。通过几何拓扑和压电颗粒梯度分布的协调设计，该系统在深部界面区域实现轴向传导和梯度电信号输出。此外，嵌入的微针结构锚定在宿主松质骨中，为恢复界面长期力学提供结构基础。
研究思路
针对上述挑战，重庆医科大学附属第一医院韩晓旭教授、白定群教授和上海交通大学医学院附属瑞金医院王娟教授等通讯作者团队构建了一种轴向梯度电通道梯度微针（GMN）以促进损伤TBI界面的结构再生。在US触发下，GMN将压电组分的轴向梯度与几何拓扑耦合，实现电信号的低衰减轴向递送并产生高空间分辨率梯度电场。首先，水凝胶微针阵列用作点对点电通道结构，US声辐射力引导钛酸钡（BTO）纳米颗粒在水凝胶微针基质内的梯度分布。该设计产生基于甲基丙烯酰化明胶（GelMA）/甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）的轴向梯度电通道腱骨梳，称为GMN。表征了不同凝胶浓度GMN的力学性能。有限元分析（FEA）用于评估US刺激下GMN独立电通道单元内部梯度电场的传导损耗差异。体外声电转换实验验证了US激活的GMN模拟指导BMSC从软骨向骨分化的内源性电梯度的能力。在细胞实验中，免疫荧光（IF）和细胞化学染色用于检查US刺激的GMN诱导干细胞向软骨细胞和成骨细胞分化的能力。在体内，建立大鼠和猪TBI模型，使用成像和组织学染色评估GMN驱动梯度结构修复和功能恢复的疗效。转录组测序进一步阐明了GMN诱导软骨和成骨分化过程中Ca²⁺内流与JAK1-STAT3和FoxO信号通路激活之间的关联。相关内容以 Ultrasound-Triggered Tendon-Bone Comb With Axially Graded Electrical Gradients for Tendon-Bone Interface Integration 发表在 Advanced Materials！
图片解析
Scheme 1. 用于TBI损伤修复和重建的腱骨梳示意图：(A) ES和US疗法的优缺点；(B) 腱骨梳的合成和(C)微观结构；(D) 腱骨梳在猪和大鼠中的应用和机制。
图1. 临床和单细胞分析揭示TBI损伤修复中电信号递送不足：(A) 88例TBI损伤患者ES治疗后VAS疼痛评分显着降低；(B) 只有28/88例患者达到临床意义改善；(C) MRI显示联合ES治疗后TBI损伤无显着改善；(D,E) FEA显示电刺激电流穿透深度有限，而US可非侵入性到达深部组织；(F) 无监督聚类和UMAP可视化鉴定26个初步细胞簇，注释12个功能不同的MSC亚群；(G) 降维后单个MSC亚群的净密度分布；(H) Ucell算法评分显示晚期发育阶段（P7）MSCs对电刺激敏感性显着高于早期（E15）；(I) E15和P7 MSCs中与电刺激相关的DEGs功能富集分析显示PI3K-Akt、JAK-STAT和FoxO信号显着富集；(J) 早期（4周）TB染色显示新形成复合物不规则分布于宿主骨中；(K,L) 晚期（8周）H&E和SO/FG染色显示损伤后新形成界面主要被纤维瘢痕组织填充；(M) 强调需要开发轴向导电电通道结构以促进TBI高效声电信号传输。
图2. BTO和水凝胶的制备与表征：(A) BTO合成示意图；(B) BTO的SEM图像；(C) BTO的EDS mapping；(D) BTO的晶格间距图；(E) BTO的SAED图案；(F) BTO的TEM图像；(G) BTO的PFM图像；(H) BTO的粒径和zeta电位；(I) BTO的XRD图案；(J) BTO的蝴蝶滞回线、相位滞回线和d33曲线；(K) GelMA和HAMA的¹H NMR氢谱；(L) 水凝胶溶液的粘度-时间曲线；(M) BTO在溶液中的沉降速率（OD 450 nm，n=3）；(N) 梯度水凝胶的代表性照片。
图3. 腱骨梳的表征和嵌入能力：(A) 微针制造示意图；(B) 微针光学显微镜和(C) SEM图像（左，MN；右，GMN）及(D) BTO分布（红色箭头）；(E) 微针的EDS mapping；(F) GMN中BTO梯度分布的FEA；(G) US下GMN的电损耗率和(H)输出电压；(I) US下GMN中BTO梯度分布的定量；(J) GMN的降解；(K) US下3% HAMA GMN针贴片和针尖的输出电压（脉冲模式）；(L) 定量（n=3，多个非配对t检验）；(M) 微针嵌入示意图和(N) 代表性微骨折通道；(O) 微针在骨中嵌入的时间过程（绿色，微针；蓝色，细胞核；白色虚线，界面），比例尺400 μm和200 μm。
图4. 腱骨梳的多向分化效应：(A) 生物相容性测试示意图；(B) BMSCs的细胞骨架染色图像；(C) 生物活性测试示意图；(D) ARS和(E) 阿尔辛蓝染色图像；(F) 成骨相关基因表达热图（Runx2、Bglap和Sp7；n=3）；(G) 软骨生成相关基因表达热图（Col2、Sox9和Acan；n=3）；(H) BMSCs的空间分化。
图5. 腱骨梳在大鼠TBI损伤模型中治疗疗效的成像和力学评估：(A) 体内实验示意图；(B) 大鼠Micro-CT扫描[(a)横截面和(b)矢状面]和(E) BV/TV和BMD（n=3）；(C) 行为评估和(F) 相对接触面积和相对步幅长度（n=3）；(D) 力学FEA；(G) 代表性应力-应变曲线和(H) 统计学分析（n=5）。
图6. 腱骨梳在大鼠TBI损伤模型中治疗疗效的组织病理学评估：(A) TB染色和(H) 整合评估（n=3）；(B) H&E染色和(F,G) 恢复评分（n=5）；(C) SO/FG染色和(I) 连接率评估（n=5）；(D) 天狼星红染色和(J) 灰度值（n=5）；(E) OCN/COL2的IF共染色和(K) 统计学分析（n=5）。
图7. 腱骨梳在TBI损伤猪中治疗疗效的成像和组织病理学评估：(A) 猪体内实验示意图；(B) 猪MRI图像；(C) 猪Micro-CT图像[(a) 2D和(b) 3D]和(D,E) BMD和BV/TV（n=3）；(F) H&E染色和(G) 恢复评分（n=3）；(H) TB染色和(I) 整合评估（n=3）；(J) 代表性应力-应变曲线和最大失效载荷、最大应力和结构刚度的定量分析（n=3）。
图8. 转录组测序揭示腱骨梳在细胞分化中的作用：(A) DEGs分析鉴定1720个上调和1644个下调基因，成骨相关和软骨生成相关基因在GMN+US组上调；(B) GO富集分析显示GMN主要影响细胞外基质组织、胶原纤维组织、成骨和软骨分化相关修复程序；(C) GSEA显示GMN+US组成骨、软骨和骨矿化通路显着富集；(D) KEGG显示cAMP、FoxO、JAK-STAT和NF-κB信号受GMN+US调控；(E,F) Western blot分析GMN诱导软骨和成骨分化过程中FoxO和JAK-STAT通路的激活；(G-I) 成骨分化过程中GMN激活JAK1-STAT3通路，RUNX2表达增加1.94倍，JAK1-STAT3通路读数增加90%；(J,K) 软骨分化过程中GMN激活FoxO信号，COL2表达增加和FoxO通路相关蛋白上调；(L-N) 维拉帕米阻断Ca²⁺进入显着减弱软骨和成骨分化过程中FoxO和JAK-STAT信号的激活；(O) 腱骨梳可能通过调节Ca²⁺动力学进而参与FoxO和JAK-STAT信号来调控BMSC软骨和成骨分化。
结论
该研究开发了一种具有轴向电梯度的腱骨梳（GMN），实现电信号的低衰减轴向传输，从而空间指导成骨和软骨分化的有序发生。在大鼠TBI损伤模型中，US激活GMN增强界面再生并使骨整合增加101%。值得注意的是，在TBI损伤猪模型中，腱骨梳GMN也改善了修复结果，支持其转化潜力。机制上，RNA-seq鉴定了与GMN介导TBI修复相关的候选分子通路，为未来机制研究提供了基础。总之，该工作为机械敏感界面组织的再生修复提供了一种可扩展的声电策略。TBI损伤再生不仅取决于电信号的存在，更关键取决于其空间组织化传输。ES疗效不一致主要源于体内复杂环境中的场衰减和空间弥散，阻碍了深部界面区域稳定有效电生理线索的产生。研究结果表明，微针通道将信号传播限制在针轴方向，从而改善了电线索与界面组织区域之间的空间对应关系。既往组织工程支架主要依赖大尺度分隔结构，缺乏天然组织的仿生特征，从而限制了其促进TBI损伤修复的有效性。该研究通过US调节BTO纳米颗粒的轴向分布实现梯度电输出。FEA和体外实验系统表征了电场梯度。然而，体内复杂环境——如组织阻抗变化、体液导电性和动态机械载荷——可能调节电信号传输，导致体内电场分布与模拟结果之间存在差异。在TBI发育过程中，BMSCs表现出区域化成骨和软骨分化模式。嵌入微针结构实现的紧密组织耦合可能促进局部电信号传输，因为紧密电极-组织耦合已被证明可降低界面阻抗并提高电荷转移效率。体内观察到的空间组织化再生模式可能源于微针结构和梯度压电输出的协同贡献。与这一解释一致，COL2表达主要在上部软骨区域，而OCN在下部矿化区域富集。然而，仅通道结构未能重现相同的空间组织化响应，表明结构指导和梯度电刺激协同作用而非独立作用。TBI损伤主要包括肩袖和跟腱损伤。损伤后，两者均发展以纤维瘢痕形成为特征的异质性界面结构，其再生依赖于重建天然腱骨界面并恢复指导干细胞分化的空间调控线索。目前，ES已在相对可及的肌肉骨骼部位进行探索，包括肩袖损伤。对肩袖损伤患者的回顾性分析表明，以弥散电场为特征的ES难以在复杂界面环境中有效空间调制。相比之下，跟腱损伤主要涉及轴向拉伸，其力学环境更均匀稳定，有助于最小化多向应力对电信号传输的干扰。因此，选择跟腱损伤模型允许更可控的力学设置，从而更深入地理解轴向梯度电信号在TBI再生中作用的机制。该研究存在一定局限性。首先，尽管GMN表现出良好的短期生物相容性并在观察期内逐渐降解，但释放的BTO纳米颗粒的长期命运仍有待完全阐明。特别是其局部滞留、生物分布、清除动力学和潜在慢性生物学效应需要通过延长随访和定量元素示踪进一步研究。其次，该研究主要关注电生理调控，而矿化梯度、胶原排列和免疫微环境等因素需要进一步研究。此外，尽管有限元模拟和体外实验支持梯度电信号的形成，但目前尚无直接方法测量体内电场分布。最后，虽然该研究主要解决骨整合问题，但肌腱结构的重建需要进一步优化。